ESTUDIO DE BACULOVIRUS PARA EL CONTROL BIOLÓGICO DE PLAGAS
Víctor Romanowski, M. Leticia Ferrelli, Matías L. Pidre, M. Laura Fabre, Tomás Masson

La sustitución de los insecticidas químicos de amplio espectro por agentes de control biológico que no sean tóxicos para especies distintas a la plaga es uno de los objetivos de una agricultura sustentable. En la actualidad, las restricciones en la aplicación de agroquímicos contaminantes son cada vez mayores, y ante ello se requiere la implementación de métodos alternativos de bajo impacto ambiental. Entre los virus entomopatógenos, sólo los baculovirus se destacan por su potencial en el desarrollo de insecticidas biológicos, habiéndose registrado y utilizado con éxito en distintas partes del mundo.

Los baculovirus tienen características que los hacen excelentes pesticidas: son altamente específicos, ya que en general cada miembro de esta familia infecta a una sola especie de insecto; producen una enfermedad mortal en el mismo y son capaces de persistir en el ambiente fuera de su hospedador. Si bien los baculovirus han sido utilizados desde hace décadas como controladores de diversas plagas, no han sido capaces de competir comercialmente con los insecticidas químicos en cuanto a su amplio espectro y velocidad de acción. En este sentido, los insecticidas químicos cuentan con la ventaja de combatir diversas plagas simultáneas de forma rápida; pero también son tóxicos para otros organismos, incluso insectos benéficos y humanos. Por el contrario, los baculovirus exhiben un nivel de seguridad inigualable: solo atacan a la especie de insecto para la cual son específicos y son inocuos para los demás organismos. Esta característica puede ser una limitación cuando se encuentra más de una plaga de manera simultánea en un cultivo.

En nuestro laboratorio realizamos estudios de baculovirus candidatos a ser utilizados en el control biológico de plagas de importancia agrícola: Los granulovirus EpapGV y SfGV, candidatos a ser utilizados como bioinsecticidas sobre el barrenador de los brotes Epinotia aporema y la oruga militar tardía Spodoptera frugiperda, respectivamente. Estos insectos lepidópteros son plagas importantes que afectan cultivos de leguminosas en nuestro país. Por otro lado los nucleopoliedrovirus AgMNPV, AcMNPV y SfMNPV son específicos de las plagas Anticarsia gemmatalis (oruga de las leguminosas), Rachiplusia nu y S. frugiperda, respectivamente. Nuestros estudios se centran en la caracterización básica de los mismos y para la mejora de sus propiedades como bioinsecticidas.

ESTUDIO DE BACULOVIRUS QUE INFECTAN A LOS LEPIDÓPTEROS PLAGA SPODOPTERA FRUGIPERDA Y EPINOTIA APOREMA
Víctor Romanowski, M. Leticia Ferrelli, Matías L. Pidre, M. Laura Fabre, Tomás Masson

La “oruga militar tardía” o “Cogollero del maíz” Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) es una plaga polífaga que ataca principalmente cultivos de alfalfa, maíz y soja. Es de gran importancia debido a su voracidad, capacidad de dispersión y hábitos de ataque. Si bien en esos cultivos es donde ocasiona daños mayores, se la encuentra también en algodón, avena, caña de azúcar, poroto, papa, sorgo, trigo y hortícolas. S. frugiperda es una plaga nativa y de amplia distribución en las regiones tropicales y subtropicales de las Américas, aunque recientemente se reportó su presencia en el continente africano. Dada su vasta distribución también en nuestro país, el cultivo de maíz se ve ampliamente afectado ya que es uno de los más importantes y distribuidos de la Argentina.

Daño por S. frugiperda en maíz no transgénico. Fotos: Lic. Sofía Torres

La estrategia clásica utilizada para el control de S. frugiperda es el uso de pesticidas químicos, para los cuales S. frugiperda es capaz de generar resistencia (Yu, 1991). Otra estrategia, en el caso del maíz, consiste en el uso de maíz transgénico que expresa la toxina Cry1F de Bacillus thuringienis, la cual es específica de lepidópteros. Si bien es una estrategia con resultados exitosos, se han informado casos de resistencia por parte de esta plaga. Cabe destacar que el resto de los cultivos atacados por este insecto no cuentan con la tecnología Bt, de manera que son más susceptibles a los daños por S. frugiperda. Esto plantea la necesidad de contar con estrategias complementarias y/o alternativas para el control de S. frugiperda, que sean efectivas y, a la vez, saludables para el medio ambiente. En este sentido, el uso de baculovirus es sin dudas una alternativa promisoria y de gran utilidad.

S. frugiperda es susceptible al nucleopoliedrovirus de S. frugiperda (SfMNPV) que constituye uno de los entomopatógenos de mayor prevalencia en las poblaciones naturales de la plaga y que se encuentra distribuido ampliamente en América. Además, S. frugiperda también es susceptible al granulovirus de S. frugiperda SfGV. En nuestro grupo contamos con aislamientos autóctonos de estos virus que nos proponemos caracterizar a fin de ser utilizados para el control biológico de la oruga militar tardía.

Larvas S. frugiperda infectadas con diferentes dosis de SfGV ARG: 17 dpi, 104 OB/ml (a); 12 dpi, 106 OB/ml (b); 21 dpi, 10E4 OB/ml (c); 14 dpi, 108 OB/ml (d); 14 dpi, 108 OB/ml (e).

El “barrenador de los brotes” Epinotia aporema (Walsingham, 1914) (Lepidoptera: Tortricidae) es una plaga importante de cultivos tales como soja, poroto, arveja, haba, lino y algodón. En su estado larval, se alimenta preferentemente de los órganos en crecimiento y de los tejidos meristemáticos (por ej. brotes). En la actualidad, se utilizan para su control insecticidas químicos de amplio espectro y alta toxicidad que, además de ser contaminantes, limitan la implementación de un correcto manejo integrado de plagas debido a su escasa selectividad.

Este lepidóptero es susceptible al granulovirus de EpapGV, capaz de provocar una infección poliorganotrópica y causar la muerte del insecto en pocos días. En nuestro grupo contamos con un aislamiento autóctono de EpapGV que cuyo trabajo se ha centrado en la caracterización de este virus como potencial bioinsecticida y actualmente cuenta con el registro de SENASA para su uso experimental.

Los granulovirus (género Betabaculovirus) no poseen líneas celulares susceptibles que permitan realizar ensayos in vitro, a diferencia de los nucleopoliedrovirus (género Alphabaculovirus), de manera que el estudio de los mismos se realizan en los insectos hospedadores. Esto representa una limitación para avanzar en el conocimiento de estos virus. Por lo tanto, en nuestro laboratorio dirigimos estudios para abordar este problema.

Los estudios básicos realizados sobre estos virus son de fundamental importancia en para su empleo como bioinsumo agrícola: el conocimiento de genomas completos, como también la funcionalidad de genes virales, contribuirá a predecir, controlar y monitorear aspectos relacionados con el rango de hospedadores, aparición de resistencia y nivel de bioseguridad de los baculovirus en el contexto de su aplicación como bioinsecticidas. Esta información facilitará el mejoramiento genético y el diseño de estrategias de control microbiológico más eficientes de las plagas con impacto agronómico.

SISTEMAS DE BACULOVIRUS TENDIENTES A MEJORAR LA CAPACIDAD BIOINSECTICIDA
V. Romanowski, S. Haase, M.L. Fabre, M.L. Pidre, M.L. Ferrelli

El nucleopoliedrovirus de Anticarsia gemmatalis (AgMNPV) ha sido utilizado con mucho éxito en Brasil para el control de la “oruga aterciopelada de las leguminosas”. Sin embargo, su utilización generalizada se encuentra limitada por varios factores, que incluyen el rango de hospedadores reducido, el tiempo letal prolongado, y la actitud de los productores, que a priori prefieren los insecticidas químicos de acción rápida. Estos aspectos son más críticos en climas más templados como en nuestro país.

En el laboratorio ya se han desarrollado AgMNPV recombinantes infectivos por vía oral que expresan la proteína fluorescente verde GFP. En base a estudios de complementación y transactivación de promotores heterólogos realizados por nuestro equipo de investigación se desarrollará un sistema de producción de virus recombinantes basados en AgMNPV que apunta a optimizar sus características como bioinsecticida. Las estrategias principales apuntan a facilitar el ingreso de los virus derivados de cuerpos de oclusión (ODVs) a las células del epitelio intestinal de las larvas (infección primaria per os), la interferencia con funciones vitales del insecto mediante la inserción de genes tóxicos específicos y el acortamiento de la llegada de los productos génicos a los sitios blanco. Esta experiencia se podrá trasladar a otros baculovirus (como SfMNPV) de impacto para el control de las plagas relevantes en la región.

Actualmente se está desarrollando una estrategia alternativa novedosa que se basada en la producción de cuerpos de oclusión (OB: occlusion body) de baculovirus en líneas celulares transgénicas que expresan proteínas heterólogas candidatas dirigidas a incorporarse en trans en el cuerpo de oclusión de AgMNPV.

Esta estrategia evita la modificación genética del baculovirus, y presenta la ventaja de incorporar las proteínas en el OB, pudiendo ejercer su acción de un modo inmediato al momento de su disolución en el intestino del insecto. Para ello se incorporarán proteínas insecticidas direccionadas al OB mediante la fusión a la proteína de la envoltura del poliedro del virus (PEP) de AgMNPV, o a la metaloproteasa Enhancin1 (E1) del virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Lymantria dispar (LdMNPV). De esta manera, los OB actuarán como portadores de proteínas que colaboran con la degradación de la membrana peritrófica en el intestino del insecto (proteasas, quitinasas), y/o afectan al sistema nervioso de la larva (toxinas específicas).

En términos generales, se apunta generar nuevas herramientas y conocimientos aplicables al mejoramiento de la eficiencia de estos virus como agentes de biocontrol.

ESTUDIO DE BACULOVIRUS PARA SU USO EN ESTRATEGIAS DE VACUNACIÓN
V. Romanowski, A. E. Ure, M. L. Pidre, P. N. Arrías

La Fiebre hemorrágica argentina (FHA) es una enfermedad emergente causada por el virus Junín (JUNV), se caracteriza por alteraciones cardiovasculares, inmunológicas, hematológicas, renales y neurológicas. Los primeros casos registrados aparecieron a mediados de la década del 50 y, desde entonces, se ha informado una gran variación en el número de casos anuales (entre 100 y 800, y hasta 3000 en años excepcionales) en el área endémica que se extiende en la Pampa Húmeda. Por ello, la enfermedad ha tenido un considerable impacto en la salud y en la economía de la Argentina. Es importante destacar que en el área endémica de la FHA se ha venido realizando una intensa campaña de vacunación destinada fundamentalmente a proteger a la población con mayor riesgo de contraer la enfermedad. La vacuna utilizada, se formuló con una cepa de virulencia atenuada del JUNV. Sin embargo, dado que se trata de una vacuna a virus vivo, no puede aplicarse a pacientes inmunodeprimidos y mujeres embarazadas. Por ello, es pertinente el desarrollo de una vacuna segura que elimine el riesgo de contraer la enfermedad y que otorgue una protección eficaz contra el agente etiológico. En términos generales este tipo de consideraciones es aplicable a otras vacunas que forman parte de las estrategias de prevención de enfermedades infecciosas.

En este proyecto proponemos como objetivo generar baculovirus recombinantes que expresen antígenos de JUNV con el fin de desarrollar, una plataforma de expresión de proteínas heterólogas (combinando la exposición de antígenos en forma particulada/nanoestructurada con la transducción de DNA) que sea útil en el desarrollo de vacunas para uso humano.

La elección de la FHA como objeto de este estudio se basa en la disponibilidad de un conjunto de materiales y herramientas en nuestro laboratorio (variantes virales, clones, sistemas de diagnóstico rápido, muestras biológicas, anticuerpos policlonales y monoclonales, entre otros), que agilizará el análisis y la obtención de resultados y conclusiones. El sistema se podrá adaptar para la producción de otras aplicaciones.

DESARROLLO DE VECTORES BACULOVIRALES PARA SU USO EN TERAPIA GÉNICA
V. Romanowski, M. L. Pidre

Los baculovirus son virus envueltos que infectan principalmente lepidópteros pero que además tienen la capacidad de transducir células de diferentes vertebrados. Esto implica que las partículas virales son capaces de ingresar a las células de mamífero, introducir su genoma, conducir a la expresión de cierta información genética pero de ninguna manera generar nuevas partículas virales ni diseminarse. Esta característica, entonces, puede ser aprovechada para utilizar a los baculovirus en vectores eficientes para el delivery de información genética en modelos animales ya sea para la expresión de proteínas recombinantes como de RNA de interferencia.

En el marco de una colaboración con la Dra. Adriana Seilicovich y la Dra. María Florencia Gottardo del Instituto de Investigaciones Biomédicas (INBIOMED, UBA-CONICET), desarrollamos vectores de transferencia útiles para la generación de baculovirus AcMNPV recombinantes capaces de expresar shRNA (short hairpin RNA). En ese contexto, el target molecular elegido fue un péptido mitocondrial con capacidad citoprotectora denominado Humanina, que se encuentra sobre-expresado en diferentes tipos tumorales, y su análogo en rata (Ratina). Como primer área de aplicación, se utilizó el baculovirus como vector de terapia génica en tumores pituitarios de rata, obteniendo resultados significativamente alentadores en relación a la sobrevida y a la progresión tumoral in vivo.

Actualmente, nos encontramos colaborando además con la Dra. Marianela Candolfi y la Dra. Gabriela Jaita, utilizando este baculovirus en otros tipos celulares tumorales.

En este proyecto de colaboración conjunta, proponemos además la identificación de nuevostargets moleculares para el tratamiento de diferentes tipos de tumores y la generación de nuevos vectores para el delivery de shRNA específicos de los mismos.

MECANISMOS PATOGÉNICOS EN LA INFECCIÓN POR ARENAVIRUS
R. M. Gómez, V. Romanowski, MF Ferrer, M. L. Perez Vidakovics, A. E. Ure, M. L. Pidre, P. N. Arrías

Esta linea de trabajo se centra en la caracterización de diversos mecanismos celulares en respuesta a arenavirus con distinta patogenicidad. Se trabaja con diversos cultivos celulares primarios y líneas celulares.

ROL DE NOD2 EN LA RESPUESTA INMUNE INNATA EN INFECCIONES CON VIRUS JUNÍN
Agustín E. Ure (IR), V Romanowski, M. L. Perez Vidakovics

La fiebre hemorrágica argentina (FHA) es una enfermedad endemo-epidémica que afecta principalmente a trabajadores agropecuarios y cuyo agente etiológico es el virus Junín (JUNV). Se considera que cinco millones de individuos están en riesgo de contraer la enfermedad y, si bien existe una vacuna atenuada, la FHA sigue siendo una infección potencialmente letal y de notificación obligatoria en nuestro país. Este proyecto de investigación tiene como objetivo general establecer los mecanismos moleculares que subyacen a la activación de la respuesta inmune innata ante el JUNV. Ello incluye establecer cuáles son los receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) del hospedador responsables de la identificación del virus y cuáles son los patrones moleculares reconocidos en el virus (PAMPs). Por otra parte, se busca además comprender los mecanismos de evasión que emplea el virus para lograr su diseminación en el hospedador. Recientemente se demostró que el PRR NOD2 (nucleotide-binding oligomerization domain 2) es capaz de reconocer RNAs virales de cadena simple como los de los virus sincicial respiratorio, de la estomatitis vesicular e influenza. Sin embargo, se desconoce si es capaz de reconocer el RNA de arenavirus. El estudio de las interacciones involucradas en los mecanismos de la inmunidad innata y su eventual modulación en infecciones por arenavirus, permitirá el desarrollo de mejores estrategias preventivas y terapéuticas contra las fiebres hemorrágicas que provocan.

ROL DE LA AUTOFAGIA Y DEL COMPLEJO ESCRT EN LA REPLICACIÓN Y BROTACIÓN DEL VIRUS JUNÍN (JUNV)
M. L. Pérez Vidakovics (IR), A.E. Ure, V. Romanowski, R.M. Gómez

Como parte integral del sistema inmune, la autofagia participa en la detección de virus e inducción de defensas antivirales; p. ej., transfiere selectivamente ácidos nucleicos virales a endosomas para estimular la respuesta inmune innata vía receptores tipo Toll o TLRs (Toll-like receptor). En contraparte, los virus han desarrollado estrategias que directa o indirectamente alteran la autofagia y promueven uno o varios de los estadios de su ciclo viral. La familia Arenaviridae está compuesta por virus de RNA, varios de ellos responsables de fiebres hemorrágicas (FH) mortales en humanos. En nuestro país, el virus Junín (JUNV) provoca la FH Argentina (FHA), una enfermedad endemo-epidémica. Actualmente 5 millones de individuos se consideran en riesgo de contraer FHA, la cual presenta una tasa de mortalidad de 20%. Estudios recientes sugieren que los arenavirus pueden utilizar la autofagia para promover su replicación y brotación viral. Las proteínas de la matriz de los arenavirus pueden interaccionar con varios de los componentes del complejo ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport). Este complejo proteico está involucrado en la formación y cierre de los autofagosomas. Paralelamente, varias proteínas involucradas en los mecanismos de señalización del IFN participan también en la regulación de la autofagia. En individuos con FHA, la severidad y el pronóstico de la enfermedad se correlaciona con elevados niveles de IFN. Estudios recientes demuestran que la autofagia juega un rol crítico en la producción de IFN durante la infección con HIV y que los mecanismos de señalización dependientes de TLR7 regulan este proceso. Este proyecto tiene por objetivo principal evaluar el rol de la autofagia, y los mecanismos de señalización asociados a este proceso celular, en la replicación y patogénesis de JUNV. Dado que la autofagia celular está íntimamente relacionada con el tránsito vesicular y la secreción de exosomas, pretendemos evaluar también el rol de estos mecanismos en la brotación de JUNV. Estudiar y comprender estos mecanismos permitirá el desarrollo de mejores estrategias preventivas y terapéuticas contra la FHA y otras FH arenavirales.

MECANISMOS INNATOS EN LA RESPUESTA DEL HUÉSPED A LA INFECCIÓN POR LEPTOSPIRA SPP
R. M. Gómez, E. Scharrig

Esta línea de trabajo se centra en la caracterización que Leptospira spp produce en funciones específicas de células de la defensa inanata del huésped.
La leptospirosis, enfermedad infecciosa reemergente, es la zoonosis más importante a nivel mundial; causada por espiroquetas del género Leptospira. Puede presentarse esporádicamente o en brotes epidémicos durante o después de inundaciones, siendo una infección potencialmente letal (la forma pulmonar severa se manifiesta por una hemorragia pulmonar masiva con una alta tasa de mortalidad) y de notificación obligatoria. Sin embargo permanece subdiagnosticada tanto a nivel humano como veterinario infiriendo grandes pérdidas económicas, ya sea por internación obligatoria de los enfermos así como por las restricciones sanitarias internacionales en el comercio exterior. Es por ello que son clave para el desarrollo de métodos rápidos de diagnóstico y nuevos tratamientos específicos de la leptospirosis el estudio de los mecanismos involucrados en la patogénesis incluyendo la respuesta inmune del hospedador.

CARACTERIZACIÓN DE MECANISMOS PATOGÉNICOS EN LAS INFECCIONES POR ENTEROVIRUS B
RM Gómez, MF Ferrer

Colaboradores externos: Cristina Lema. Servicio de Neurovirosis, ANLIS Malbrán.
Esta linea de trabajo estudia diversos mecanismos patogénicos presentes en la miocarditis viral gatillada por diversos picornavirus y también realiza analísis filogenéticos, filodinámicos y estructurales en virus aislados en muestras de pacientes con meningitis.

CARACTERIZACIÓN DE MECANISMOS PATOGÉNICOS EN LAS INFECCIONES POR VIRUS THEILER
RM Gómez, MF Ferrer

El virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV) abarca dos subgrupos. El primero, representado por la cepa GDVII, produce una enfermedad encefalitis aguda, alta mortalidad y ausencia de persistencia viral. En contraste, las cepas del subgrupo TO, producen una enfermedad aguda más leve del SNC donde la mayoría de los animales sobreviven pero que al cabo de varias semanas desarrollan un proceso desmielinizante que afecta principalmente la sustancia blanca de la médula espinal. El virus persiste en forma restringida y tanto la respuesta inmune del huésped como el virus contribuyen al proceso patológico. El tema de trabajo actual es conocer el papel de los receptores tirosina kinasa Tyro3, Axl y Mert (conocidos como receptores TAM) en la infección.